01 試劑的原因

02 樣品的原因

我們發(fā)現(xiàn)，很多用戶會(huì)誤認(rèn)為：只要被測(cè)物的主要成分相同，方法就是通用的。但實(shí)際上，色譜的根本目的是分離。即使主要被測(cè)成分相同，只要樣品中其他組分存在差異（不僅包括被測(cè)雜質(zhì)，還包括輔料、基質(zhì)、溶劑等），對(duì)色譜條件的要求就會(huì)不同。

這也是我們經(jīng)常看到原料藥與制劑在前處理方法和檢測(cè)方法上存在顯著差異的原因之一。由此可見，當(dāng)樣品發(fā)生改變時(shí)，原有的色譜條件往往不再適用，常見影響包括：

? 樣品溶劑或進(jìn)樣體積的變化，會(huì)引入不同程度的溶劑效應(yīng)；

? 輔料、基質(zhì)種類或含量的變化，不僅會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，甚至可能對(duì)色譜柱造成直接損傷；

（這也是為什么在制劑分析和食品分析中，盡管前處理過程復(fù)雜繁瑣，但相關(guān)色譜柱的使用壽命仍普遍偏低的原因之一）；

? 研發(fā)階段的反應(yīng)液，其組成和濃度差異極大，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)波動(dòng)也就不足為奇。

03 儀器的原因

儀器是色譜系統(tǒng)中最昂貴的組成部分，目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的也都是進(jìn)口品牌設(shè)備，因此我們往往對(duì)其信任度較高，進(jìn)而容易忽略由儀器帶來的差異。

但不可否認(rèn)，幾乎所有從業(yè)者都遇到過這樣的情況：更換一臺(tái)儀器，或同一臺(tái)儀器經(jīng)過維修后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生變化。

1. 死體積

死體積的負(fù)面影響大家已較為熟悉，這里不再贅述。在此特別分享一個(gè)在實(shí)際應(yīng)用中觀察到的“特殊現(xiàn)象"：當(dāng)從進(jìn)樣器到色譜柱入口的死體積較大時(shí)，樣品與流動(dòng)相在這一段中的混合會(huì)更加充分，從而在一定程度上削弱溶劑效應(yīng)。

而如今的新型儀器普遍追求更小的死體積，這也是為什么新型號(hào)儀器有時(shí)反而更容易出現(xiàn)溶劑效應(yīng)的原因之一。

2. 實(shí)際流動(dòng)相比例

在等度條件下，色譜柱內(nèi)環(huán)境保持不變，只要儀器提供的溶劑比例足夠準(zhǔn)確，通常不會(huì)產(chǎn)生明顯問題。獲取流動(dòng)相的方式主要有兩種：

1）人工配置 + 單相運(yùn)行

這種方式只要操作規(guī)范，一般具有良好的穩(wěn)定性。

2）儀器在線混合

不同設(shè)計(jì)的儀器在在線混合溶劑時(shí)，實(shí)際輸出的比例可能存在差異：低壓混合系統(tǒng)在某些相比例較小時(shí)，誤差會(huì)明顯增大；此外，不同儀器泵模塊的設(shè)計(jì)及混合邏輯差異，也會(huì)導(dǎo)致實(shí)際輸出的溶劑比例不同（例如部分采用校正因子，部分采用預(yù)壓縮技術(shù)）。

3. 梯度條件下的復(fù)雜性

在梯度條件下，問題會(huì)顯著放大。由于色譜柱內(nèi)的流動(dòng)相環(huán)境是連續(xù)變化的，且同一時(shí)刻柱內(nèi)不同位置的環(huán)境并不一致，因此，只有嚴(yán)格控制每一時(shí)刻的柱內(nèi)環(huán)境，才能獲得理想的重現(xiàn)性。

這就要求：輸送至色譜柱入口的溶劑比例與流速，必須與時(shí)間嚴(yán)格一一對(duì)應(yīng)。

其中，流速之所以重要，是因?yàn)樗苯佑绊懱荻冗^程中柱內(nèi)環(huán)境的變化速率；而在等度條件下，由于選擇性保持不變，微小的流速差異通常不會(huì)顯著影響結(jié)果。

4. 梯度“并非你看到的那樣"

需要特別注意以下幾點(diǎn)：

1）梯度延遲

我們?cè)谔荻缺碇性O(shè)置的參數(shù)，控制的是儀器各模塊執(zhí)行動(dòng)作的時(shí)間，而并非流動(dòng)相真正到達(dá)色譜柱入口的時(shí)間。

2）梯度并非真正連續(xù)

盡管方法中設(shè)定的梯度曲線是連續(xù)平滑的（無論是線性還是曲線），但由于液相系統(tǒng)采用往復(fù)式柱塞泵，在單次沖程中輸出的溶劑比例是固定的，因此實(shí)際梯度變化呈現(xiàn)為“階梯狀"，而非真正連續(xù)變化。

3）不同儀器 = 不同梯度曲線

結(jié)合不同泵模塊設(shè)計(jì)及控制邏輯的差異，不同儀器實(shí)際輸出的梯度曲線必然存在差別。在緩梯度方法中，這種差異往往會(huì)被進(jìn)一步放大。

04 色譜柱的原因